小鼠原代真皮成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

1. 組織消化與細(xì)胞分離
將剪碎的真皮組織轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（含1%膠原酶Ⅰ），37℃水浴消化30分鐘，期間每10分鐘輕柔吹打一次以促進(jìn)組織解離。消化完成后，加入等體積含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)，1000 rpm離心5分鐘，棄上清。

2. 細(xì)胞懸液制備與接種
用PBS重懸細(xì)胞沉淀，經(jīng)70 μm細(xì)胞篩過(guò)濾去除未消化的組織塊，再次離心后以完全培養(yǎng)基（DMEM+10% FBS+1%雙抗）重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至5×10? cells/mL，接種于預(yù)先包被0.1%明膠的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

3. 原代細(xì)胞培養(yǎng)與觀察
24小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)基以去除未貼壁細(xì)胞，此后每2-3天換液一次。在倒置顯微鏡下觀察，成纖維細(xì)胞通常呈梭形或多角形，貼壁生長(zhǎng)后可形成典型的放射狀或漩渦狀排列。若發(fā)現(xiàn)雜細(xì)胞（如角質(zhì)形成細(xì)胞）污染，可采用差速貼壁法純化：將細(xì)胞懸液接種30分鐘后，轉(zhuǎn)移未貼壁細(xì)胞至新培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)。

4. 細(xì)胞傳代與凍存
當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化2-3分鐘，按1:2至1:3比例傳代。凍存時(shí)以含10% DMSO的完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×10? cells/mL，分裝至凍存管后程序降溫，長(zhǎng)期保存于液氮中。

注意事項(xiàng)
- 組織消化時(shí)間需根據(jù)小鼠年齡調(diào)整（幼鼠組織更易消化）；
- 原代細(xì)胞前3代增殖活躍，建議優(yōu)先使用P3-P5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；
- 定期檢測(cè)支原體污染，培養(yǎng)液中可添加2.5 μg/mL兩性霉素B預(yù)防真菌污染。